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　　糠醛又稱呋喃甲醛，是重要的雜環(huán)類有機(jī)化合物?？啡╊惢衔镆呀?jīng)在白酒、葡萄酒、黃酒中檢測(cè)到。在白酒中，醬香型白酒的糠醛含量最高。在白酒生產(chǎn)中，原料玉米、高粱、稻殼等含有的多縮戊糖在低pH值下在蒸餾過程中水解為戊醛糖，戊醛糖進(jìn)一步脫水環(huán)化生成糠醛。研究發(fā)現(xiàn)，糠醛對(duì)酵母菌的生長具有一定的抑制作用，影響原料出酒率。

　　研究結(jié)果表明，醬香型白酒在蒸餾過程中產(chǎn)生的大量糠醛，并沒有完全蒸餾至酒中，在酒醅中有著較高的殘留。在醬香型白酒酒醅堆積過程中，糠醛含量大量減少，堆積后，糠醛的含量降低，有的可以降解至出池酒醅的水平。不少研究表明，微生物可以利用糠醛發(fā)酵產(chǎn)生糠醇。因此，研究醬香型白酒堆積過程糠醛降解微生物，對(duì)進(jìn)一步明晰醬香型白酒的堆積機(jī)理，縮短堆積時(shí)間，提高醬香型白酒的出酒率具有重要意義。

　　1材料與方法

　　1.1材料與設(shè)備

　　酒醅  某白酒廠堆積6d的醬香型酒醅，取樣后于－20℃保存； 糠醛、糠醇、2—辛醇，色譜純；糠醛、氯化鈉、氯化芐，分析純； 限制性內(nèi)切酶、Taq DNA Po lym erase、dNTP（25mmo l/L）、ITS 引物。
    　

　　氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀( GC 6890—5975 MSD ) ；PCR 儀( PC300 )  EppendorfM aster persona；l電泳儀、凝膠成像儀 B IO—RAD；冷凍高速離心機(jī)3K 15 美國Sigma—A ldrich公司； 掃描電子顯微鏡  FE IQuanta 200。

　　1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

　　1.2.1  平板分離培養(yǎng)基

　　以糠醛為唯一碳源的培養(yǎng)基：糠醛5g，KNO3 10g，N aCl 5g，瓊脂20g，加去離子水至1000mL，調(diào)節(jié)pH 到5.5，于121℃濕熱滅菌30min。

　　1.2.2  搖瓶培養(yǎng)基 酒醅浸提液：50g 酒醅中加入100mL離子水，超聲30min，離心后抽濾，共收集3次。在酒醅浸提液中添加適量糠醛，搖瓶培養(yǎng)糠醛降解菌。

　　1.3 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.3.1 菌種分離 

　　在滅菌后的三角瓶中盛入適量酒醅，添加去離子水，用玻璃珠打散后浸泡過夜，三角瓶口覆蓋有紗布。將酒醅浸泡液梯度稀釋涂布于分離平板上，置于37℃培養(yǎng)箱中。

    　1.3.2 菌種鑒定 

　　采用氯化芐抽提真菌DNA：培養(yǎng)液離心抽濾后，收集菌絲體，轉(zhuǎn)入5mL離心管中，加入0.7mL 提取液（100mmo l/L Tris—HCl， pH9.0；40mmol /L EDTA，pH 8.0），1mL 10% SDS，1.5mL 氯化芐，劇烈振蕩使其成乳狀，50℃保溫1h。加入1.2mL 3mmol/L的NaAc，冰浴15min，6000r/min離心15min，取上清液。加入等體積的異丙醇， 0.1倍體積的0.3mol/L NaAc，10000r/m in 離心10min，棄上清液，再加入200uLTE 溶解，文章來源華夏酒報(bào)100uL苯酚，100uL氯仿抽提，混合均勻，在12000r/m in 下離心5m in。取上清液于另一1.5mL 離心管中，進(jìn)行酚—仿抽提2次—3次。加入上清液等體積的異戊醇，在12000 r/min下離心5min。取上清液于另一1.5mL 離心管中，加入2.5倍— 3倍體積的無水乙醇，放入冰浴30min，于16000r /m in下離心2m in，棄上清液，用70% (v/v)100uL乙醇沉淀，16000r/min下離心2min。去上清液，倒置至干，加40uLTE 于－20℃中放置過夜，0.8% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

    　采用通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增整個(gè)ITS序列，把所得的ITSrDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，利用Blasta工具進(jìn)行序列比對(duì)，對(duì)目的菌株進(jìn)行鑒定。

    　1.3.3  色譜條件

　　用Agilent GC 6890—5975MSD對(duì)樣品進(jìn)行鑒定，通過DB—Wax毛細(xì)管柱進(jìn)行分離。

    　程序升溫條件為50℃保持2min，然后10℃/min升溫至230℃，保持1min。進(jìn)樣口溫度為250℃，載氣為高純度He；流速為2mL/min。分離后的樣品用Agilent 5975MSD鑒定。質(zhì)譜條件：E I電離源；電子能量：70eV；離子源溫度：230℃；掃描范圍：35amu—350amu。

    　1.3.4  標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

　　以酒醅浸提液作為標(biāo)準(zhǔn)品配制。取合適濃度的糠醛、糠醇的標(biāo)樣，添加到適量酒醅浸提液中。以2—辛醇為內(nèi)標(biāo)，使用二氯甲烷進(jìn)行微萃取。萃取相通過GC—MS 分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    　1.3.5  糠醛及糠醇的定量　

　　通過檢出物質(zhì)譜圖和N IST05a.L Database中標(biāo)準(zhǔn)譜圖的比對(duì)，以及通過添加標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗(yàn)證。以2—辛醇為內(nèi)標(biāo)，經(jīng)過GC—MS檢測(cè)后，將待測(cè)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)的相對(duì)峰面積比代入相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出待測(cè)物質(zhì)在酒醅浸提液中的含量。

　　2 結(jié)果與分析

　　
    　2.1 菌株的篩選

    　在以糠醛為唯一碳源的分離培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選，經(jīng)過分離、純化，從酒醅樣品中分離出了一株霉菌，將該菌株接種于添加了一定量糠醛的酒醅浸提液中搖瓶培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)菌株繁殖生長速度較快。通過對(duì)酒醅浸提液的成分檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)糠醛含量隨著菌株的大量繁殖而迅速減少，且糠醇含量增多。

    　2.2 分離菌株的鑒定

    　2.2.1 菌株的ITS rDNA 測(cè)序結(jié)果 將利用氯化芐抽提基因組的方法進(jìn)行測(cè)序。
    　掃描電鏡下，其分生孢子長橢圓形，呈長鏈著生， 斷開后兩端平載，結(jié)果基本符合宛氏擬青霉分生孢子的特征。

    　2.2.２ 菌株的鑒定　

　　將利用氯化芐抽提基因組方法所得的ITSrDNA序列提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫，利用Blasta工具進(jìn)行序列比對(duì)，對(duì)目的菌株進(jìn)行鑒定。

　　鑒定結(jié)果為宛氏擬青霉Paecilomyces variotii。該菌株在泥土、室內(nèi)環(huán)境、植物、動(dòng)物和食品中普遍存在。它是一個(gè)耐熱真菌，繁殖速度快，且能夠在低氧以及存在防腐劑的環(huán)境中生長。

　　目前， 國內(nèi)外學(xué)者在降解糠醛菌種的馴化和篩選方面進(jìn)行了大量研究。

3 結(jié)論 

　　本實(shí)驗(yàn)從醬香型白酒酒醅中篩選出了一株高效降解糠醛的菌株，利用氯化芐抽提基因組的方法可以有效地鑒定出該菌株為宛氏擬青霉。

　　通過對(duì)降解過程的底物糠醛及產(chǎn)物糠醇的定量分析可以發(fā)現(xiàn)，該菌株降解糠醛速度快，為高效降解糠醛菌。宛氏擬青霉對(duì)酒醅中糠醛降解為糠醇有較大影響，從而證明了降解糠醛過程中微生物的作用。