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用微生物生產(chǎn)多糧濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的研究尹昌樹1，劉波1，張義正3，陳大理1，岳明生
　以五糧液為代表的宜賓多糧濃香型白酒的生產(chǎn)離不開當(dāng)?shù)鬲?dú)特的自然環(huán)境。作為中國(guó)酒都，地處三江交匯處，宜賓特殊的氣候環(huán)境孕育出了獨(dú)特的釀酒微生物生態(tài)區(qū)系。一般認(rèn)為，在濃香型白酒生產(chǎn)過程中，霉菌主要起糖化作用，酵母發(fā)酵產(chǎn)生酒精，細(xì)菌主要參與形成白酒復(fù)雜的風(fēng)味和香氣。四川省申聯(lián)生物科技有限責(zé)任公司的科技人員利用純培養(yǎng)的方法對(duì)多糧濃香型白酒生產(chǎn)環(huán)節(jié)中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌開展研究，篩選出5株對(duì)宜賓多糧濃香型白酒酒體獨(dú)特風(fēng)格起主要作用的微生物菌株，并運(yùn)用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)及超臨界萃取技術(shù)生產(chǎn)出多糧濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)。

    　1材料與方法
    　1.1材料
    　1.1.1菌種

　從四川某濃香型酒廠釀酒車間的窖泥、酒糟、曲藥、黃水中篩選。分別編號(hào)SL0015、SL0061、SL0098、SL0106、SL0158，4℃保藏備用。

    　1.1.2試劑
    　高純二氧化碳，食品級(jí)99.99%。
    　1.1.3主要儀器和設(shè)備

　Agilent CC 6890－5975rnfKs，美國(guó)安捷倫科技有限公司；AgilentC－C6890－FID，美國(guó)安捷倫科技有限公司；DD－6低速大容量離心機(jī)，濟(jì)南福的機(jī)械有限公司；超臨界萃取設(shè)備，HA120－50－01A，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；UF－20型實(shí)驗(yàn)型超濾裝置，華泰凈化技術(shù)工程有限公司；10L發(fā)酵罐，50L發(fā)酵罐，江蘇鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司。

    　1.1.4培養(yǎng)基
    　1.1.4.1種子液培養(yǎng)基
    　牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、葡萄糖胰胨培養(yǎng)基。
    　1.1.4.2發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）

    　1.2 方法
    　1.2.1種子液培養(yǎng)
    　將菌種接種于種子培養(yǎng)液中，其中SL0015、SL0098、SL0106培養(yǎng)溫度42℃，150rpm，培養(yǎng)28小時(shí)。SL0061、SL0158培養(yǎng)溫度35℃，靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)3天。

    　1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)
    　1.2.2.1各菌種單獨(dú)培養(yǎng)。
    　1.2.2.2各菌種混合培養(yǎng)。
    　1.2.3感官評(píng)定

　品評(píng)人員由國(guó)家評(píng)酒委員和從事白酒研究工作并經(jīng)過半年聞香訓(xùn)練的人員組成。每個(gè)樣品由4名品評(píng)人員分3次進(jìn)行品評(píng)。在20℃的品評(píng)環(huán)境下，評(píng)價(jià)發(fā)酵液的濃香，按很弱、弱、一般、強(qiáng)、很強(qiáng)5個(gè)等級(jí)分類。

　1.2.4發(fā)酵液中特征性風(fēng)味化合物的分析

　1.2.4.1GC—MS分析
　樣品通過DB—Wax毛細(xì)管柱進(jìn)行分離，程序升溫條件：初溫40℃，恒溫5min，然后以8℃/min的速率升至230℃，保持30min。進(jìn)樣量：1μL，不分流。載氣：He；流速：2 mL/min。分離后的樣品用Agilent5975MSD鑒定。質(zhì)譜條件El：電離源；電子能量：70eV；離子源溫度：230℃；掃描范圍：30amu—550amu。

　1.2.4.2 物質(zhì)定性分析
　將未知物質(zhì)譜圖與NIST 08a.L Database（Agilent Technologies Inc．）中標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比對(duì)定性。

　1.2.5超臨界CO₂ 萃取

　1.2.5.1預(yù)處理
　發(fā)酵液→粗過濾→超濾→清液

　1.2.5.2　
　取1L發(fā)酵清液投入萃取釜，將萃取釜溫度升至設(shè)定值后開啟CO₂ 泵，萃取壓力升至設(shè)定值后進(jìn)行流動(dòng)萃取，從解析釜出料口得萃取物，將所得液體進(jìn)行GC－MS分析。

　2結(jié)果與討論

　2.1單獨(dú)培養(yǎng)與混合培養(yǎng)比較

　發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。通過菌種單獨(dú)培養(yǎng)與混合培養(yǎng)所產(chǎn)香氣的比較可以看出，篩選出的菌株進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，所產(chǎn)香氣均不強(qiáng)，而混合培養(yǎng)，則香氣濃。這與菌種間的協(xié)同作用有關(guān)，因?yàn)槟撤N菌種的產(chǎn)物可能是另一種菌種的前體物質(zhì)，或是兩種菌種的產(chǎn)物在酶的作用下進(jìn)行一些反應(yīng)，如酯化反應(yīng)等。

　2.2混合培養(yǎng)條件的研究

　2.2.1培養(yǎng)基的選擇

　利用上述培養(yǎng)基分別發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，通過不同培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況及產(chǎn)香情況的比較可知，培養(yǎng)基A營(yíng)養(yǎng)豐富，菌種生長(zhǎng)快，但產(chǎn)香弱；培養(yǎng)基C產(chǎn)香強(qiáng)，但生長(zhǎng)太慢；而培養(yǎng)基B取了A、C的優(yōu)點(diǎn)，菌種生長(zhǎng)較快，產(chǎn)香強(qiáng)。選培養(yǎng)基B作為以下試驗(yàn)的培養(yǎng)基。

　2.2.2培養(yǎng)溫度的選擇
　我們以下列控溫方式做試驗(yàn)：①35℃，②先35℃后42℃，③42℃，發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

　通過不同控溫方式對(duì)產(chǎn)香的影響比較可知，控溫方式以先35℃后42℃為最佳。

　2.3超臨界CO₂ 萃取條件的研究

　2.3.1萃取溫度的確定

　超臨界CO₂ 的臨界點(diǎn)為7.52MPa、31.1℃，因此試驗(yàn)的溫度、壓力都不能低于這個(gè)數(shù)值。另外，由于超臨界CO₂所萃取的物質(zhì)一般都為熱敏性物質(zhì)，萃取溫度不能太高，所以對(duì)萃取溫度的調(diào)節(jié)非常重要。通過四組單因素試驗(yàn)確定萃取溫度，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 萃取溫度選取試驗(yàn)