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　　以五糧液為代表的宜賓多糧濃香型白酒的生產(chǎn)離不開當(dāng)?shù)鬲?dú)特的自然環(huán)境，作為中國(guó)酒都，地處三江交匯處，宜賓特殊的氣候環(huán)境孕育出了獨(dú)特的釀酒微生物生態(tài)區(qū)系。
　　一般認(rèn)為，在濃香型白酒生產(chǎn)過程中，霉菌主要起糖化作用，酵母發(fā)酵產(chǎn)生酒精，細(xì)菌主要參與形成白酒復(fù)雜的風(fēng)味和香氣。
　　四川省申聯(lián)生物科技有限責(zé)任公司的科技人員利用純培養(yǎng)的方法對(duì)多糧濃香型白酒生產(chǎn)環(huán)節(jié)中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌開展研究，并篩選出5株對(duì)宜賓多糧濃香型白酒酒體獨(dú)特風(fēng)格起主要作用的微生物菌株。
　　四川省申聯(lián)生物科技有限責(zé)任公司運(yùn)用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)及超臨界萃取技術(shù)，生產(chǎn)出多糧濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)。

表1　菌種單獨(dú)培養(yǎng)與混合培養(yǎng)所產(chǎn)香氣的比較

表2　不同培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況及產(chǎn)香情況的比較

表3　不同控溫方式對(duì)產(chǎn)香的影響

表4　不同PH條件對(duì)產(chǎn)香的影響

表5　不同接種量的試驗(yàn)

表6　不同接種量對(duì)產(chǎn)香的影響

表7　萃取溫度選取試驗(yàn)

表8　萃取壓力選取試驗(yàn)

表9　CO₂流量的選取試驗(yàn)

表10　分離溫度的選取試驗(yàn)

表11　分離壓力的選取試驗(yàn)

1材料與方法
    　1.1材料
    　1.1.1菌種
    　從四川某濃香型酒廠釀酒車間的窖泥、酒糟、曲藥、黃水中篩選。分別編號(hào)SL0015、SL0061、SL0098、SL0106、SL0158，4℃保藏備用。
    　1.1.2試劑
    　高純二氧化碳，食品級(jí)99.99%。
    　1.1.3主要儀器和設(shè)備
    　Agilent CC 6890-5975 rnfKs，美國(guó)安捷倫科技有限公司；Agilent C-C 6890-FID，美國(guó)安捷倫科技有限公司；DD-6低速大容量離心機(jī)，濟(jì)南福的機(jī)械有限公司；超臨界萃取設(shè)備，HA120-50-01A，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；UF-20型實(shí)驗(yàn)型超濾裝置，華泰凈化技術(shù)工程有限公司；10L發(fā)酵罐，50L發(fā)酵罐，江蘇鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司。
    　1.1.4培養(yǎng)基
    　1.1.4.1種子液培養(yǎng)基
    　牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、葡萄糖胰胨培養(yǎng)基。
    　1.1.4.2發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）
　　葡萄糖　20；小麥粉　10；酵母膏　1；（NH₄）₂SO₄　0.5；MgSO₄·7H₂O　　0.2；FeSO₄·7H₂O　0.1；K₂HPO₄·3H₂O　0.2 ；高粱粉　10；乙醇　20。
    　1.2方法
    　1.2.1種子液培養(yǎng)
    　將菌種接種于種子培養(yǎng)液中，其中SL0015、SL0098、SL0106培養(yǎng)溫度42℃，150rpm，培養(yǎng)28小時(shí)。SL0061、SL0158培養(yǎng)溫度35℃，靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)3天。
    　1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)
    　1.2.2.1各菌種單獨(dú)培養(yǎng)。
    　1.2.2.2各菌種混合培養(yǎng)。
    　1.2.3感官評(píng)定
    　品評(píng)人員由國(guó)家評(píng)酒委員和從事白酒研究工作并經(jīng)過半年聞香訓(xùn)練的人員組成。每個(gè)樣品由四名品評(píng)人員分三次進(jìn)行品評(píng)。在20℃的品評(píng)環(huán)境下，評(píng)價(jià)發(fā)酵液的濃香，按很弱、弱、一般、強(qiáng)、很強(qiáng)五個(gè)等級(jí)分類。
    　1.2.4發(fā)酵液中特征性風(fēng)味化合物的分析
    　1.2.4.1GC-MS分析
    　樣品通過DB-Wax毛細(xì)管柱進(jìn)行分離，程序升溫條件：初溫40℃，恒溫5min，然后以8℃/min的速率升至230℃，保持30min。
　　進(jìn)樣量：1μL，不分流。載氣：He；流速：2 mL/min。分離后的樣品用Agilent 5975MSD鑒定。質(zhì)譜條件El：電離源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230℃；掃描范圍：30amu～550amu。
    　1.2.4.2 物質(zhì)定性分析
    　將未知物質(zhì)譜圖與NIST 08a.L Database（Agilent Technologies Inc．）中標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比對(duì)定性。
    　1.2.5超臨界CO₂萃取
    　1.2.5.1預(yù)處理
    　發(fā)酵液→粗過濾→超濾→清液
    　1.2.5.2　
    　取1L發(fā)酵清液投入萃取釜，將萃取釜溫度升至設(shè)定值后開啟CO2泵，萃取壓力升至設(shè)定值后進(jìn)行流動(dòng)萃取，從解析釜出料口得萃取物，將所得液體進(jìn)行GC—MS分析。
2結(jié)果與討論
    　2.1單獨(dú)培養(yǎng)與混合培養(yǎng)比較
    　發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見表1。
    　從表1可以看出，篩選出的菌株進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，所產(chǎn)香氣均不強(qiáng)，而混合培養(yǎng)，則香氣濃。
　　這與菌種間的協(xié)同作用有關(guān)，因?yàn)槟撤N菌種的產(chǎn)物可能是另一種菌種的前體物質(zhì)，或是兩種菌種的產(chǎn)物在酶的作用下進(jìn)行一些反應(yīng)，如酯化反應(yīng)等。
    　2.2混合培養(yǎng)條件的研究
    　2.2.1培養(yǎng)基的選擇
　　培養(yǎng)基A（g/L）
　　牛肉膏　10；蛋白胨 　5；酵母膏　5；葡萄糖  40；（NH4）2SO4 0.5 ；MgSO4·7H2O　0.2；FeSO4·7H2O　0.1；K2HPO4·3H2O　0.2；CaCl2　0.1。
    　培養(yǎng)基B（g/L）
　　葡萄糖　20；小麥粉　10；酵母膏　1；（NH4）2SO4　0.5；MgSO4·7H2O 0.2；FeSO4·7H2O　0.1；　K2HPO4·3H2O　0.2；高粱粉　10；乙醇　20。
    　培養(yǎng)基C（g/L）
　　小麥粉　10；高粱粉　10；玉米粉　8；大米粉　5；糯米粉　5。
　　利用上述培養(yǎng)基分別發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2。
    　從表2可知，培養(yǎng)基A營(yíng)養(yǎng)豐富，菌種生長(zhǎng)快，但產(chǎn)香弱；培養(yǎng)基C產(chǎn)香強(qiáng)，但生長(zhǎng)太慢；而培養(yǎng)基B取了A、C的優(yōu)點(diǎn)，菌種生長(zhǎng)較快，產(chǎn)香強(qiáng)。我們選培養(yǎng)基B作為以下試驗(yàn)的培養(yǎng)基。
    　2.2.2培養(yǎng)溫度的選擇
    　我們以下列控溫方式做試驗(yàn)：①35℃②先35℃后42℃③42℃，發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見表3。
    　從表3可以看出，控溫方式以先35℃、后42℃為最佳。
    　2.2.3培養(yǎng)PH的選擇
    　我們分別維持PH5、6、7、8進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見表4。
    　從表4可以看出，PH在6時(shí)產(chǎn)香最強(qiáng)。
    　2.2.4　接種量的選擇
    　我們?cè)O(shè)計(jì)的試驗(yàn)見表5。
    　發(fā)酵結(jié)束后，取樣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見表6。
    　從表6可以看出，菌種SL0015、0061、0098、0106、0158按5%、10%、5%、5%、10%的接種量接種進(jìn)行混合培養(yǎng)，產(chǎn)香最強(qiáng)。
    　2.3超臨界CO₂萃取條件的研究
    　2.3.1萃取溫度的確定
    　超臨界CO₂ 的臨界點(diǎn)為7.52 MPa、31.1 ℃, 因此試驗(yàn)的溫度、壓力都不能低于這個(gè)數(shù)值。另外，由于超臨界CO2 所萃取的物質(zhì)一般都為熱敏性物質(zhì)，萃取溫度不能太高，所以對(duì)萃取溫度的調(diào)節(jié)非常重要。通過四組單因素試驗(yàn)確定萃取溫度，試驗(yàn)結(jié)果見表7。
    　通過以上試驗(yàn)可以看出，3號(hào)樣雖然萃取率略低于2號(hào)樣，但其風(fēng)味更佳，所以萃取溫度選為45℃。
    　2.3.2萃取壓力的確定
    　選取萃取壓力的試驗(yàn)結(jié)果見表8。
    　從表8可以看出，13號(hào)樣品萃取率高且風(fēng)味好，因此萃取壓力確定為15MPa。
    　2.3.3 CO₂流量的確定
    　選取CO₂流量的試驗(yàn)結(jié)果見表9。
    　從表9可以看出，不同的CO₂流量對(duì)所得萃取物的品質(zhì)無影響，但在相同的萃取時(shí)間下， 流速越大，萃取得率越高。因此確認(rèn)CO₂ 流量為10L/h。
    　2.3.4分離溫度的確定
    　選取分離溫度的試驗(yàn)結(jié)果見表10。
　　從表10可以看出，分離溫度越低，萃取率越高，但品質(zhì)不好，所以分離溫度選取為50℃。
    　2.3.5分離壓力的確定
    　選取分離壓力的試驗(yàn)結(jié)果見表11。
    　從表11可以看出，分離壓力越大，萃取率越低，但品質(zhì)更好，綜合考慮確定分離壓力為7MPa。
    　2.3.6 解析釜壓力、溫度的確定
    　為確保在解析釜中萃取物質(zhì)的完全解析，解析壓力越低越好，但考慮到CO₂能重復(fù)利用，因此，解析壓力與CO₂ 儲(chǔ)罐中壓力相同，即在4.5～6.0MPa之間，解析釜溫度設(shè)定為55℃。
    　2.3.7 萃取時(shí)間的確定
    　萃取時(shí)間在4h 文章來源華夏酒報(bào)后，產(chǎn)品得率很小， 亞油酸、7-烯十六酸，萃取時(shí)間為4h。
　　2.4萃取物的分析
　　以萃取壓力15 MPa,萃取溫度45℃，CO₂ 流量為10L/h，柱分離壓力為7MPa, 分離溫度為50℃，解析釜分離壓力為4.5～6.0MPa, 溫度為55℃，萃取時(shí)間為4h作為控制條件進(jìn)行超臨界CO₂萃取, 萃取得率為5.48%。把萃取物進(jìn)行GC-MS分析，得到萃取物的質(zhì)譜圖。
　　萃取物中主要成分如下：
    　醇類：乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、仲丁醇、正戊醇、2-戊醇、異戊醇、β-苯乙醇、正己醇、2-庚醇、3-甲基苯甲醇、9,12,15-三烯十八醇。
    　多元醇：1，2-丙二醇、2，3-丁二醇、1，,3-丁二醇、丙三醇。
    　酸類：乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸、苯乙酸、十五酸、十六酸、十七酸、十八酸、油酸、亞油酸、7-烯十六酸。
    　酯類：乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、十三酸乙酯、苯乙酸乙酯、甲酸-2-丁酯、乙酸異戊酯、十五酸乙酯、十六酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、十七酸乙酯、亞麻酸乙酯、油酸癸酯、油酸單甘油酯、乳酸乙酯、苯甲酸乙酯、月桂酸乙酯、苯丙酸乙酯、丁二酸單乙酯、甲氧基乙酸乙酯、11-十六烯酸乙酯、2-氯油酸乙酯、琥珀酸雙乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯。
    　酚：對(duì)丁酸甲酯酚、對(duì)乙醇酚、對(duì)乙基酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。
    　胺：乙酰胺、3-甲基丁酰胺。
    　烷：辛烷、1，1-二氧基戊烷、1，1-二乙氧基異戊烷、2-乙氧基苯烷、2，3-二苯基丁烷。
    　酮：丙酮、5-甲基-2-己酮、6，10，14-三甲基-2-十四酮。
    　醛：乙醛、異丁醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、苯甲醛、2，4-二烯癸醛。
    　雜環(huán)類：苯乙酰吡唑、2-苯基-4，5-二甲基-1，3-二氧五環(huán)、2-苯基-1，3-二氧六環(huán)、2-苯基-4-甲基-1，3-二氧五環(huán)、糠醇、2-甲酰吡咯、2-羥基-3，4，5-三氫呋喃、2-羥基吡咯、氮甲基-2，4-二烯-2-甲酰吡咯、三甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2，6-二乙基吡嗪、四甲基吡嗪、吡啶、3-羥基吡啶、糠醛、2-戊基呋喃。
3結(jié)論
    　3.1確定多菌種混合發(fā)酵的培養(yǎng)模式
　　以篩選的微生物菌株進(jìn)行多糧濃香型白酒的呈香呈味物質(zhì)的生產(chǎn)，并確定了多菌種混合發(fā)酵的培養(yǎng)模式
    　3.2確定超臨界CO₂萃取最佳工藝
　　萃取壓力15MPa，萃取溫度45℃，CO₂ 流量為10L/h，柱分離壓力為7MPa, 分離溫度為50℃，解析釜分離壓力為4.5～6.0 MPa，溫度為55℃，萃取時(shí)間為4h。

    　3.3所得萃取液具有典型風(fēng)味
　　所得萃取液經(jīng)專家鑒定，具有典型的多糧濃香型白酒的風(fēng)味，白酒固態(tài)發(fā)酵感強(qiáng)，糧香突出、糟香優(yōu)雅、窖香柔和。多家酒廠試用后，均反響強(qiáng)烈。