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    　采用泡沫陶瓷固定化酵母細(xì)胞，并對其應(yīng)用于啤酒連續(xù)主發(fā)酵進(jìn)行了實驗研究，獲取了優(yōu)化的工藝條件。發(fā)酵溫度16℃，稀釋率0.044h－1。在此工藝條件下，實際測得濃度降低為7.09%，嫩啤酒雙乙酰含量為0.144mg /L。對嫩啤酒主要理化指標(biāo)的測定結(jié)果表明：采用固定化酵母細(xì)胞啤酒主發(fā)酵工藝不會對啤酒質(zhì)量造成影響。

    　固定化技術(shù)應(yīng)用于啤酒的工業(yè)化生產(chǎn)，主要是為了實現(xiàn)連續(xù)快速發(fā)酵的目的。

　　首先，固定化技術(shù)應(yīng)用在后發(fā)酵階段獲得了成功，目前已應(yīng)用于整個啤酒的發(fā)酵過程，包括主發(fā)酵階段。固定化酵母細(xì)胞常采用的方法是在聚合物載體中進(jìn)行包埋，將其應(yīng)用于啤酒的主發(fā)酵卻難以實現(xiàn)。由于載體結(jié)構(gòu)及尺寸的原因，只有固定在載體表面的酵母與麥汁中的溶氧接觸、繁殖旺盛，而包埋于載體內(nèi)的酵母與氧的接觸少，或因酒精在載體內(nèi)的積累，使酵母繁殖受到抑制，因而酵母對α—氨基氮的同化率低，主發(fā)酵完畢的酒液存在著游離α—氨基氮和雙乙酰含量過高的質(zhì)量問題，不易解決。

    　泡沫陶瓷是多孔網(wǎng)絡(luò)狀陶瓷材料，其孔徑比酵母細(xì)胞大得多，而且采用吸附固定化的方法，吸附于載體表面及多孔網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的酵母細(xì)胞與麥汁能夠充分接觸，比較適合應(yīng)用于啤酒的主發(fā)酵。在已完成了固定化酵母細(xì)胞制備技術(shù)的基礎(chǔ)上，對泡沫陶瓷固定化酵母細(xì)胞啤酒連續(xù)主發(fā)酵工藝進(jìn)行實驗研究，獲取優(yōu)化的工藝條件。

1材料與方法

    　1.1 實驗材料

    　載體　泡沫陶瓷由景德鎮(zhèn)陶瓷研究所提供；原料　添加酒花并經(jīng)煮沸冷卻的11°P麥汁，浙江錢江啤酒廠提供；啤酒酵母　生產(chǎn)用零代酵母，浙江錢江啤酒廠提供。

    　1.2 實驗方法

    　1.2.1 泡沫陶瓷固定化酵母細(xì)胞生物催化劑的制備為優(yōu)化泡沫陶瓷固定化酵母細(xì)胞生物催化劑的制備。14℃條件下于反應(yīng)器中吸附酵母細(xì)胞20min，然后在相同溫度條件下連續(xù)培養(yǎng)4h， 固定化酵母可達(dá)到的細(xì)胞密度為： 1.1 ×10⁸ 個/mL麥汁。

    　1.2.2 泡沫陶瓷固定化酵母細(xì)胞啤酒連續(xù)主發(fā)酵系統(tǒng)

　　泡沫陶瓷固定化酵母細(xì)胞啤酒連續(xù)主發(fā)酵系統(tǒng)，將麥汁貯存于貯罐中，通過計量泵將麥汁輸入泡沫陶瓷固定化酵母細(xì)胞填充床反應(yīng)器中，進(jìn)行啤酒連續(xù)主發(fā)酵，同時發(fā)酵終了的嫩啤酒貯于貯罐中。反應(yīng)器帶有夾套，用酒精制冷，調(diào)節(jié)其流量可控制發(fā)酵溫度。進(jìn)出口處設(shè)取樣口。反應(yīng)器容積為84.8L，LD= 0.3m，L /D= 4ε（床孔隙率）＝54%。

    　本研究中稀釋率的定義及控制：

    　D = F / （εVR ）= 1 /τ

    　其中，D 為稀釋率， h^—1；ε為床孔隙率；VR 為反應(yīng)器容積，L；F 為麥汁流量，L·h^—1；τ為平均停留時間，h。通過調(diào)節(jié)計量泵可改變麥汁流量，從而可調(diào)控稀釋率。

    　1.2.3泡沫陶瓷固定化酵母細(xì)胞啤酒連續(xù)主發(fā)酵實驗　

　　為使固定化連續(xù)發(fā)酵技術(shù)能應(yīng)用于啤酒的整個發(fā)酵過程，在保證主發(fā)酵終了時酒液實際濃度較低的前提下，雙乙酰含量也應(yīng)盡可能的低，所以確定主發(fā)酵實驗綜合考察酒液濃度的降低及雙乙酰含量這兩個指標(biāo)，影響因素主要是發(fā)酵溫度和稀釋率。通過預(yù)實驗確定中心點（零水平），應(yīng)用二次通用旋轉(zhuǎn)中心組合實驗設(shè)計的方法來安排實驗。兩因素（發(fā)酵溫度和稀釋率）上、下水平及r的取值依據(jù)是酵母細(xì)胞對溫度的要求及預(yù)期的發(fā)酵時間。對實驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析及優(yōu)化處理，獲取泡沫陶瓷固定化酵母細(xì)胞啤酒連續(xù)主發(fā)酵優(yōu)化的工藝條件。

    　1.2.4 嫩啤酒主要理化指標(biāo)的測定　

　　對主發(fā)酵結(jié)束后的嫩啤酒進(jìn)行酒精含量、原麥汁濃度、總酸含量和雙乙酰文章來源華夏酒報含量等主要理化指標(biāo)的測定，以考察采用泡沫陶瓷固定化酵母細(xì)胞啤酒連續(xù)主發(fā)酵工藝是否影響啤酒的質(zhì)量。酒精含量：蒸餾法；原麥汁濃度： 比重瓶法；總酸含量：滴定法；雙乙酰含量：蒸餾法。

2 結(jié)果與分析

    　2.1 泡沫陶瓷固定化酵母細(xì)胞啤酒連續(xù)主發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化通過計量泵將麥汁輸入固定化酵母填充床反應(yīng)器，按實驗方案控制發(fā)酵溫度（ x₁ ）及稀釋率（ x₂），進(jìn)行連續(xù)主發(fā)酵實驗。

　　首先在反應(yīng)器入口處取樣測定原麥汁濃度，反應(yīng)器起動后，需經(jīng)一段時間方可達(dá)到擬穩(wěn)態(tài)，此時于反應(yīng)器出口處測得的實際濃度和雙乙酰的含量基本保持不變。由進(jìn)出口處麥汁濃度的測定值計算出濃度的降低，濃度的降低（%）和雙乙酰的含量（mg /L）分別用y1和y2表示。二次通用旋轉(zhuǎn)中心組合實驗設(shè)計方案及實驗結(jié)果如表1所示。

    　利用DPS統(tǒng)計分析軟件, 對實驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析, 可得兩個實驗指標(biāo)與兩因素之間的回歸關(guān)系方程：

     y¹₁ = 6.90401＋ 0.92749x₁－ 2.10231x₂ －0.46211x₂¹－0.01698x²₂ ＋ 0.01000x₁ x₂ （方程式1）
    y¹₂ = 0.15160＋0.01779x₁＋ 0.01006x₂＋0.04140x₂¹＋0.00539x²₂ ＋0.00175x₁ x₂ （方程式2）

    　對回歸方程式1和方程式2分別進(jìn)行顯著性檢驗，方差分析的結(jié)果表明：回歸（方程式1和 2）均在α＝0.001水平上高度顯著，兩方程中x22和x1 x2 項的回歸系數(shù)均在0.1水平上不顯著， 所以應(yīng)從方程中剔除該不顯著項，得簡化后的回歸方程分別為：

    　y ¹₁ = 6.90401+0.92749x₁ －0.10231x₂－ 0.46211x²₁ （方程式 3）
    　y¹₂ = 0.15160+0.01779x₁+ 0.01006x₂+ 0.04140x²₁ （方程式4）

　　要滿足固定化酵母細(xì)胞啤酒連續(xù)后發(fā)酵的工藝要求，應(yīng)使?jié)舛鹊慕档痛笥?.0%，或者十分接近這一數(shù)值；主發(fā)酵結(jié)束時雙乙酰的含量不應(yīng)超過0.190mg /L。

    　可采用模型模擬的方法， 對回歸方程式 3和方程式4在約束條件y₁ > 7.0，y₂ < 0.190下進(jìn)行非線性優(yōu)化。利用DPS統(tǒng)計分析軟件，在和的取值范圍內(nèi)，對回歸方程式（ 3）和式（ 4）進(jìn)行模擬運(yùn)算， 當(dāng)y₁ =7.0063， y₂ = 0.1415 時，x₁ = 0 （16.0℃），x₂ = —1（0.044h^{- 1}）。在發(fā)酵溫度16℃，稀釋率0.044h^－1條件下，進(jìn)行驗證實驗，測得濃度降低為7.09% ， 嫩啤酒雙乙酰含量為0.144mg /L，實測值非常接近預(yù)期值。

    　2. 2 嫩啤酒主要理化指標(biāo)的測定結(jié)果在優(yōu)化的工藝條件下，進(jìn)行泡沫陶瓷固定化酵母細(xì)胞啤酒連續(xù)主發(fā)酵，測定嫩啤酒的主要理化指標(biāo)，并與采用傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的嫩啤酒進(jìn)行比較，結(jié)果如表2所示。傳統(tǒng)工藝主發(fā)酵時間約為6d左右；采用泡沫陶瓷固定化酵母工藝主發(fā)酵時間很短，在上述優(yōu)化的工藝條件下約為23h，極大縮短了發(fā)酵時間。

    　由嫩啤酒主要理化指標(biāo)的測定結(jié)果可知，采用固定化酵母工藝，嫩啤酒的幾項主要理化指標(biāo)均與傳統(tǒng)工藝比較接近，可以認(rèn)為該工藝不會對啤酒質(zhì)量造成影響。

3 討論

    　主發(fā)酵時間為20h—26h，嫩啤酒雙乙酰含量為0.3mg /L—0.5mg /L；上述實驗結(jié)果的發(fā)酵時間為23h，嫩啤酒雙乙酰含量為0.144mg /L。發(fā)酵時間與文獻(xiàn)接近，但主發(fā)酵結(jié)束后嫩啤酒雙乙酰含量要低很多，將有利于后發(fā)酵雙乙酰的還原。

表1  二次通用旋轉(zhuǎn)中心組合實驗設(shè)計方案及結(jié)果

表2  嫩啤酒的主要理化指標(biāo)